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圖片來源：7500/7500 Fast Real-Time PCR System GETTING STARTED GUIDE

實(shí)驗(yàn)設(shè)置：

a.實(shí)驗(yàn)名稱

b.儀器型號

c.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模憾俊enotyping(基因分型)、定性（有/無）

d.定量類型：標(biāo)準(zhǔn)曲線、相對標(biāo)準(zhǔn)曲線、相對定量

e.實(shí)驗(yàn)方法：探針法、染料法

f.模板類型：gDNA、cDNA

g.Target設(shè)置：Target包括目的基因、內(nèi)參基因（多少個和名稱）。

探針法需要選擇使用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。

h.標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定：幾個點(diǎn)、每點(diǎn)幾個重復(fù)、定義標(biāo)準(zhǔn)量范圍。

圖片來源：qPCR進(jìn)階攻略——帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器設(shè)置！-Yeasen

i.樣本設(shè)置：Sample包括實(shí)驗(yàn)組、對照組、負(fù)對照組；樣本數(shù)、每樣本重復(fù)數(shù)、陰性對照數(shù)、樣本選擇和命名。

j.反應(yīng)孔的設(shè)置：根據(jù)樣品的排布選中面板上的加樣孔，勾選左邊對應(yīng)的目的基因及模板。

注意：不應(yīng)為了方便將所有孔選成同一個Target同一個Sample，這樣排布會造成比較大的風(fēng)險。我們通過下面的例子進(jìn)行說明：

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我們同一塊板上同時擴(kuò)增兩個基因，而布孔時選成同一個Target，那么儀器默認(rèn)的都是同一個閾值，假如布孔時都選成Target1，紅色這條閾值線對于Target1是合理的，但對于Target2則不合理，因?yàn)檫@時已經(jīng)不在指數(shù)擴(kuò)增期，得到的Ct值并不可信。

反應(yīng)程序設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的Master Mix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10分鐘）。

a.反應(yīng)體系設(shè)置：

反應(yīng)體系的配制，不得不說到參比／校正染料（reference dye，passive dye）。常用的是ROX或者其他染料，只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。

參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROX配制在MasterMix或者Premixture里，也有的是單獨(dú)分開。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROX染料校正。比如Bio-RAD的系列儀器就不需要。

需要注意一點(diǎn)ABI儀器的需要加ROX參比染料的，默認(rèn)的是ROX，要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個步驟的選擇。如BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none"。

b.兩步法或三步法：qPCR反應(yīng)可以將退火與延伸兩步進(jìn)行合并，條件需要根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整，根據(jù)qPCR引物設(shè)計原則，引物的Tm值在60℃左右，因此這一步的溫度一般可設(shè)為60℃。

c.熒光信號采集：對于染料法而言，兩步法檢測的熒光信號采集應(yīng)該在退火延伸的整合步驟；三步法應(yīng)當(dāng)在72℃延伸時采集，此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài)；Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。以ABI 7500為例，選擇在哪一步采集熒光信號點(diǎn)亮其下面的小方塊即可。

d.熔解程序：使用染料法進(jìn)行熒光定量PCR時，我們通常會在擴(kuò)增階段完成后進(jìn)行熔解曲線分析，幫助確定產(chǎn)物類型，判斷是否有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。

以SYBR Green法為例，SYBR Green染料只有結(jié)合到雙鏈DNA的小溝中才能發(fā)出熒光，擴(kuò)增反應(yīng)完成后，對產(chǎn)物逐漸升溫同時監(jiān)測每一步的熒光信號，隨著溫度升高，DNA雙鏈解開，產(chǎn)物熒光信號下降。

溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。溫度一般設(shè)置在60℃-95℃區(qū)間，能包含產(chǎn)物Tm值和非特異產(chǎn)物Tm值即可。在某個溫度下，雙鏈DNA會解鏈一半，此后剩下的一半會迅速解鏈，熒光驟降并形成變化的拐點(diǎn)，這個溫度稱為退火溫度（Tm值）。將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT)，從而生成熔解曲線。

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RUN：全部設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器，點(diǎn)擊RUN！

數(shù)據(jù)分析：

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