什么是熒光定量PCR?

更新時間：2024-12-04

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實時熒光定量PCR（Real-time qPCR）是指在PCR反應中加入熒光基團，通過連續監測熒光信號出現的先后順序以及信號強弱的變化，即時分析目的基因的初始量的一種PCR技術。

一、熒光化學物質

Real-time qPCR所使用熒光化學物質有熒光染料和熒光探針兩類。

1、熒光染料

目前主要使用的熒光染料是SYBR Green I，SYBR Green I是一種嵌入型花箐染料，在488nm（藍光）照射激發后，在522nm（綠光）具有發射高峰。

SYBR Green I是嵌在DNA螺旋的小溝里面的，一般用來染雙鏈DNA，在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

YBR Green I 與雙鏈DNA的親和力非常高，對分子生物學中常用的酶（如：Taq 酶、逆轉錄酶、內切酶、T4連接酶等）沒有抑制作用。

SYBR染料-DNA復合物在非極性溶液中可解離，可用乙醇沉淀的方法將SYBR Green I 從DNA中去除。SYBR Green I能夠被玻璃表面強烈吸收，染料溶液應該在塑料容器中配制。

SYBR Green I 染料法即將SYBR Green I染料添加到PCR反應體系中時，SYBR Green I能夠結合到模板和擴增產物發出熒光；隨著每輪擴增，產物量呈指數型上升，熒光信號也隨之累積并被儀器檢測到。

2、熒光探針

Real-time qPCR中常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的FRET探針，該探針的5'端標記熒光基團，3'端標記淬滅基團。正常情況下兩個基團的空間距離很近，熒光基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收而不能發出熒光；PCR擴增時，引物與該探針同時結合到模板上，探針的結合位置位于上下游引物之間；當擴增延伸到探針結合的位置時，PCR酶利用5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而使其發出熒光。

熒光信號被熒光監測系統接收，檢測到的熒光分子數與PCR產物的數量成正比，因此，根據PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數量。

1）熒光共振能量轉移FRET

熒光共振能量轉移是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體 Donor）的發射光譜與另一個基團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離臨近至一定范圍時（一般小于100?／10nm），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象，即以前一種熒光基團的激發波長激發時，可觀察到后一個基團發射的熒光。

簡單地說，就是在供體基團吸收一定頻率的光子后第一電子發生能級躍遷被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移的過程。

此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的，供體分子被激發后，當受體分子與供體分子相距一定距離，且供體和受體的基態及第一電子激發態兩者的振動能級間的能量差相互適應時（同一振蕩頻率），處于激發態的供體將把一部分或全部能量轉移給受體，使受體被激發，在整個能量轉移過程中，不涉及光子的發射和重新吸收。如果受體熒光量子產率為零，則發生能量轉移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發射體，則呈現出受體的熒光，并造成次級熒光光譜的紅移。

①FRET發生條件：

a.供體分子的發射光譜應與受體分子的激發光譜必須有顯著重疊（＞30%）。

b.供體分子與受體分子的作用距離必須在1-10nm之間，基團間的FRET效率可由E=1/［1+(R/R0)?］反映（R表示基團分子之間的距離；R0表示E=50%時供體和受體分子間的距離，依賴熒光基團發射譜和淬滅基團激發譜的重疊程度以及基團能量轉移的偶極子的相對方位，對于特定的供體受體對是常數）。

FRET程度與基團之間的空間距離緊密相關，隨著距離延長，FRET呈顯著減弱。

c.供體分子的發射態偶極矩與受體分子的吸收態偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件。

②FRET的應用

a.檢測分子間相互作用：

b.檢測分子的折疊與構像變化：

2）TaqMan探針

①設計原則：

a.長度：建議15-30bp，以保證結合特異性；擴增子長度應小于150 bp。

b.Tm值：68-72℃，高于引物8-10℃，可保證探針在退火時先于引物與目的片段結合，也確保探針與模板結合的穩定性大于引物與模板結合的穩定性，最好富含GC。

c.5'端／3'端：探針5'端避免為G，G堿基一定程度上對5'端熒光有淬滅作用，避免報告基團的熒光在探針切割后發生淬滅；3'端需進行封閉，以防止在PCR中起引物的作用進行延伸，TAMRA等基團本身可進行封閉。

d.堿基分布：GC含量在30%~80%之間，一條探針中，C含量多于G，G含量高會降低反應效率，這時可選擇互補的另一條鏈作為探針，避免單個核苷酸成串，如GGGGG。

e.結合位置：探針退火時，應盡可能接近上游引物，同時又不重疊，離上游引物的3'端至少相差一個堿基；如果Taqman探針是用于檢測等位基因或突變位點,則應將錯配核苷酸放在探針中間，不能放在末端。

e.純化方式：建議選擇HPLC純化。

②保存：TaqMan探針必須避光保存，避免熒光基團降解。

3）TaqMan探針法優點

①特異性強：

探針法qPCR要達到檢測的目的，不僅要上下游引物要跟模板匹配，還需要探針與模板匹配，提升了檢測的特異性。另外一方面，對于模板同源性比較高的不同目的基因的檢測和鑒定，在擴增引物特異性沒法保證的情況下，可通過設計探針的特異性來達到特異性檢測的目的。而且特異性的探針比特異性的引物對模板序列的特異性要求要低，只要模板有幾個堿基甚至1個堿基的差異就能設計特異性的探針，而這對于擴增引物是無法實現的。

②準確性、靈敏度高：

從探針法qPCR原理來看，擴增引物和探針序列都匹配后擴增的產物才能產生熒光信號，這樣就確保了熒光信號是目的片段的擴增產生的，排除了非特異性擴增的影響，從而保證了檢測的準確性。特別是針對一些低拷貝和低濃度的樣品，染料法qPCR隨著循環數的增加容易出現引物二聚體的信號干擾，導致檢測結果不準，而這種情況在探針法qPCR上不存在，因為即使出現引物二聚體，由于其不是目的片段，沒有探針結合位點，所以也不會產生熒光信號。這也體現了探針法qPCR檢測低拷貝樣品的高準確性和高靈敏度。

③可進行多重檢測：

在探針的5'端標記不同的熒光修飾，則不同的探針在檢測過程中就會發出不同的熒光信號。根據此原理，可以將檢測不同目的基因或者基因型的探針標記不同的熒光修飾，用做混合檢測，這樣就可以做多重檢測，檢測對應的熒光信號就是檢測對應探針的熒光定量結果，多重檢測大大節省檢測成本和檢測時間，進一步提高了檢測的速度和適用性。

二、定量原理

理想的PCR反應：X＝X?*2?；實際的PCR反應：X＝X?*(1＋Ex)?（n：擴增反應的循環次數，X：第n次循環后的產物量，X?：初始模板量，Ex：擴增效率）；在擴增產物達到閾值線時：XCt＝X?*(1＋Ex)??＝S （XCt：熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量，在閾值線設定以后，它是一個常數，設為S）；方程式兩邊同時取對數得: lgS＝lg［X?*(1＋Ex)??］，整理方程式得: lgX?＝-lg(1＋Ex) ??＋lgS。

結論：

①模板DNA量越多，達到熒光閾值的循環數越少，即Ct值越小。

②lg濃度與循環數呈線性關系。

a. 根據樣品擴增達到閾值的循環數（Ct值）即可計算出樣品中所含的模板量。(相對定量)

b. 通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品Ct值，即可計算出樣品中所含的模板量。（絕對定量）

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